Три недели назад премьер-министр Великобритании Борис Джонсон напугал всех сообщением о новой мутации коронавируса. Вы тоже боитесь новых мутаций? А может быть вы думаете, что это новый способ мирового правительства закрыть всех на карантин? Давайте разбираться вместе. Mне помогут мои коллеги: ученые-биологи доктор Болат Султанкулов, работающий над созданием диагностической системы для Ковид-19 на основе нанотел и исследователь университета KAUST в Саудовской Аравии, доктор медицины Мухтар Садыков, который в рамках своего PhD проекта непосредственно изучает мутации коронавируса. В этом материале мы, биологи, покажем вам как следить за мутациями SARS-CoV-2, используя первоначальные источники.

Что такое мутации? Из школьного курса биологии вы помните, что эволюция — по сути накопление адаптаций к окружающей среде. Так вот, мутации — это и есть способ адаптироваться. Вирусы — не что иное, как генетическая информация в упаковке из белка (и иногда липидов). Из-за своей простоты (и хитрости, конечно) мутируют они постоянно (в среднем до 1 млн раз быстрее человека), это их способ существования. Коронавирус SARS-CoV-2 в этом году совершил огромный рывок в развитии, он перепрыгнул на нового хозяина, — на человека. Этот выход из зоны комфорта дался ему нелегко, и он до сих пор к нам привыкает. Поэтому в мутациях нет ничего удивительного. Другое дело, что за обычными простудными коронавирусами, с которыми мы встречаемся каждый сезон, мы так тщательно не следим. Сравниваем мы SARS-CoV-2, как правило, с вирусом атипичной пневмонии 2003-2004 годов. А уж за тем, как развивается сам SARS-CoV-2, сейчас происходит беспрецедентно тщательный контроль. По вирусным меркам коронавирус не так изменчив. Было подсчитано, что в одном ВИЧ-инфицированном пациенте разница между двумя вирусами ВИЧ будет больше, чем между Уханьским и британским штаммом коронавируса! Собственно, это одна из причин, по которой до сих пор не удалось создать вакцину против постоянно «убегающего» от иммунной системы и мутирующего ВИЧ.

Как можно следить за мутациями?

Эволюционные биологи любят рисовать деревья, но не обычные, а филогенетические. Каждый листик — генетическая последовательность (например, ДНК какого-то вида животных или растений, РНК или ДНК вируса или даже аминокислотная цепочка белка). Самый удобный сайт, содержащий информацию о РНК коронавируса по всему миру — Neхtstrain.org. Информация на нем обновляется в реальном времени. Сайт был создан задолго до пандемии, и содержит информацию о распространении и эволюции многих инфекций, таких как вирус Зика, корь и туберкулез. Во время пандемии этот ресурс стал одним из важнейших инструментов борьбы с дезинформацией и фейками, так как это прекрасный пример открытости данных. Он позволяет в реальном времени понять, как быстро могут меняться вирусы и как вирус смог перепрыгнуть на нового хозяина. В этом материале мы расскажем о том, как пользоваться этим ресурсом и что мы на данный момент знаем о мутациях SARS-CoV-2.

Kакие бывают мутации и что значат все эти буквы и цифры в громких заголовках?

Генетический код, состоящий из четырех букв — это, пожалуй, самый красивый механизм в природе. Четыре буквы (А, Т, Г, Ц в ДНК и А, У, Г, Ц в РНК) обозначают четыре азотистых основания, последовательность которых и является генетическим кодом. В случае SARS-CoV-2 генетическая информация представляет собой молекулу РНК, в которой около 30 000 азотистых оснований. Сбором данных, которые используются для анализа сайтом Neхtstrain, занимается организация GISAID (первые буквы от global initiative on sharing avian influenza data). Эта организация появилась в 2006 году, чтобы объединить усилия во время эпидемии птичьего гриппа, и стала успешным примером открытости и борьбы с сокрытием данных о вспышках инфекционных заболеваний. На данный момент в открытом доступе можно найти почти 300 000 последовательностей геномов SARS-CoV-2 (геном=набор генов), которые расставлены в филогенетическом дереве с 5 января 2020 года по сегодняшний день.

Итак, у нас имеется генетический код в виде РНК — рецепт коронавируса, благодаря которому наша клетка «готовит» этот самый вирус. Во время этого процесса постоянно происходят ошибки, и, таким образом, появляются мутации. Три буквы РНК превращаются в одну аминокислоту, из которых состоят белки. Изменения в этом генетическом коде бывают разные: делеция, — когда часть кода теряется, инсерция — (или вставка) и замена одной буквы на другую без изменения количества букв в коде. Бывают мутации точечные, когда меняется одна буква генетического кода, а бывают сложные мутации, когда происходит замена, вставка или удаление целого участка. Точечные мутации могут пройти совершенно незаметно для организма, это так называемые нейтральные мутации, когда изменение буквы в генетическом коде не меняет аминокислоту, которая будет произведена. Но бывают изменения более значимые, когда меняется состав и даже форма произведенного белка. Иногда при потере нуклеотида код сдвигается и часть белка, а иногда и весь белок, вовсе теряется. Аминокислоты тоже обозначаются буквами. Для обозначения мутаций мы чаще всего используем латинские буквы, обозначающие аминокислоту и ее порядковый номер в молекуле белка. Например, нашумевшая «британская» мутация N501Y означает, что произошла замена одной аминокислоты аспарагина (N) на позиции 501 на другую — тирозин (Y). А, к примеру, мутация, которую часто находят вместе с ней, ΔH69/V70 — означает, что произошла делеция (потеря) двух аминокислот (H - гистидин, V - валин) на позициях 69 и 70.

Теперь о том, как вирус «решает», какие мутации ему нужны. Селективное давление —термин, который описывает степень воздействия естественного отбора, которая влияет на скорость появления генетических изменений. Еще в начале эпидемии высказывалось мнение, что коронавирус будет мутировать, а значит, «слабеть», чтобы не убивать хозяина. Но на самом деле,

Важно повторить, что большинство мутаций проходят незамеченными и не сохраняются в популяции. Если мутация очень сильно мешает вирусу (например, полностью отключая очень важный ген), то, скорее всего, она не сохранится попросту потому, что вирусу от нее будет слишком плохо. А выигрышной для вируса будет мутация (или группа мутаций), которая поможет закрепиться в хозяине как можно дольше, не убивая его слишком быстро, чтобы успеть распространиться. Это и увеличение «заразности» (то есть, более эффективное проникновение в клетку и длительное асимптоматическое течение), и мутации, помогающие «спрятаться» от иммунной системы (а именно, от иммунных клеток памяти и антител).

Мухтар Садыков и его коллеги в своей недавней публикации отметили важность изучения как позитивного (то есть, когда мутации необходимы вирусу для адаптации), так и негативного селекционного давления (когда участки генома важны для функционирования вируса, то частота мутаций там ниже среднего).

«Среди белков, которые мало изменились за время пандемии, обнаружены функциональные белки энзимы - nsp12 и nsp8, необходимые для воспроизведения вируса. Ремдесивир блокирует функционирование данных белков энзимов. Мы также заметили ряд белков, которые больше подвержены мутациям, среди них белки шипа и нуклеокапсида». А также в этом исследовании они предложили систему генетического штрих-кода, который ускорит определение варианта/штамма коронавируса и является доступной альтернативой полноценному секвенированию вируса.

Наибольшее количество изменений, — уже более 4000 мутаций, — происходит в знаменитом белке-шипе. Шипы на поверхности, из-за которых вирус и получил свое название (сходство с короной солнца), важны для того, чтобы прикрепиться к рецептору на поверхности клетки хозяина и заразить ее. Этот процесс можно себе представить так: вы — вирус, а ваша ладонь — белок-шип. Чтобы открыть дверь (рецептор на поверхности клеток АСЕ2) и зайти в комнату (в клетку), вы, вирус, держитесь ладошкой (белком-шипом) за ручку (участок на АСЕ2, который связывается с шипом). На этом видео вы можете посмотреть как именно происходит эта встреча.

Коротко о четырех главных мутациях

Теперь давайте проследим, как менялся коронавирус. Начать, пожалуй, следует с его происхождения. И хотя точного ответа у нас до сих пор нет, филогенетический анализ подсказывает нам, что SARS-СoV-2 ближе к коронавирусам летучих мышей и панголинов (или яванских ящеров), чем к вирусу атипичной пневмонии 2003-2004 годов SARS-СoV. Основная разница между двумя человеческими вирусами в том, что SARS-СoV-2 намного эффективнее «открывает дверь» в клетку, изменив тот самый белок-шип. И если в геноме коронавирусов летучих мышей этого «апдейта» пока не было обнаружено, то в коронавирусах панголинов схожее преимущество уже присутствует. Существуют две главные гипотезы происхождения SARS-СoV-2: он или мутировал в организме животного (летучей мыши или панголина), или же изменился до неузнаваемости уже в организме человека. Анализируя имеющиеся данные, ученые приходят к выводу о том, что искусственное создание коронавируса в лаборатории — версия хоть и интересная, но на данный момент беспочвенная. Доктор Мухтар Садыков на примере коронавируса также напоминает о важности контроля за вирусами животных:

Итак, год назад появился новый коронавирус. Генетическая последовательность, которая используется в качестве начального образца генома коронавируса, была взята у пациента из Уханя в декабре 2019 года. Вирус тут же начал мутировать, а ученые сразу начали тщательно за этим следить. Уже в январе была замечена, пожалуй, главная мутация — D614G — замена аспартата на глицин на позиции 614 в белке-шипе. Мутация стала настолько важной и удобной для вируса, что уже к июню стала доминировать во всем мире. Эти две аминокислоты сильно различаются по своим свойствам и было ожидаемо, что такое изменение может значительно повлиять на поведение вируса. Как именно? Исходя из исследований на клетках, на лабораторных животных, а также согласно эпидемиологическим данным, мы можем сделать вывод о том, что этот вариант вируса заражает эффективнее, а также лучше размножается (Hou et al Science, 18 Dec 2020) в верхних дыхательных путях. Но также было предварительно показано, что эта мутация не влияет на тяжесть заболевания, на чувствительность к нейтрализующим антителам и на эффективность вакцин.

Следующий нашумевший вариант вируса называется «Cluster 5», он был обнаружен в июне 2020 в Дании у людей, работающих с норками. Тут важно отметить, что норки — важный и давно известный резервуар для инфекций, они способствуют ускоренному изменению вируса и поэтому контроль за ними очень важен. Этот вариант вируса содержит комбинацию мутаций всё там же, в белке-шипе: делеция (потеря) аминокислот на позициях 69-70; замена Y453F внутри участка, который связывается с ACE2; замена I692V and M1229I. Датские власти, а с ними и все мы, испугались не на шутку. Чтобы ограничить дальнейшее распространение этого варианта вируса, были уничтожены около 14 млн норок. А некоторые страны, например, Нидерланды, и вовсе запретят норковые хозяйства к 2024 году. Но по предварительным данным, эта мутация не влияет на тяжесть и степень передачи инфекции. Однако, у этого варианта слегка снижена чувствительность к нейтрализующим антителам, что вызывает некоторые опасения в связи с повторным заражением. Но Дания показала пример максимально быстрого реагирования, поэтому этот вариант удается держать под контролем.

Третья важная мутация, которая стала поводом для написания этого материала, является частью так называемого британского варианта коронавируса — VOC 202012/01 (он же VUI – 202012/01, он же B.1.1.7). Обнаружен он был в октябре 2020 года, на начало января он присутствует уже в более чем 30 странах. Он содержит 23 мутации, большинство из них находится в белке-шипе. Одна из мутаций схожа с датскими норками, это делеция на позициях 69-70. А главная мутация — N501Y — является заменой аминокислоты в маленьком участке белка-шипа, который связывается с АСЕ2. Комбинация этих двух мутаций, вероятно, и объясняет повышенную контагиозность данного варианта вируса. Как мы об этом узнали? Дело в том, что один из самых популярных ПЦР тестов в Великобритании — TaqPathCOVID-19 компании Thermo Fisher. Он определяет наличие 3 участков РНК вируса. Один из них, что находится в белке-шипе в аккурат на месте делеции 69-70, вдруг перестал выявляться, тогда как другие два были на месте. Это побудило британцев на всякий случай определить полную последовательность генома и обнаружить новый вариант вируса! Этот ПЦР тест дал нам много информации о распространении этого штамма за короткий срок (следить было проще простого — двa участка вместо трех), а реакция властей и возможность проведения массового секвенирования быстро позволила нам определить точные генетические изменения. Но это также говорит о том, что, возможно, в других странах мы попросту не заметили появление этого варианта, что еще раз подчеркивает значимость секвенирования.

На что влияет это изменение вируса? Ключевым фактором здесь является, видимо, комбинация мутаций, что, возможно, изменяет не только состав, но и форму шипа и других белков, что является своеобразной попыткой сбежать от «наручников» нейтрализующих (умелых, качественных) антител, которые должны в идеале сформироваться у нас по результату знакомства с вирусом или (внимание!) с вакциной. У нас есть некоторые данные о том, как эти мутации могут по отдельности влиять на поведение вируса. Так, потеря двух аминокислот на позициях 69-70 не только снижает эффективность некоторых диагностических тестов, как было описано выше, но также она, возможно, возникла в результате использования терапии плазмой переболевших пациентов.

Следовательно, эта мутация может привести к тому, что вирус сможет избежать иммунного ответа антителами. Также в этом варианте присутствуют 6 мутаций в гене ORF1ab, но они пока мало изучены. Другой интересной мутацией является P681H, которая влияет на слияние мембраны клетки и оболочки вируса, что, возможно, помогает вирусу проникать в клетки респираторного эпителия, а также облегчает передачу вируса на животных моделях. Еще одно важное изменение: белок ORF8, который очень изменчив и значительно различается с аналогичным белком SARS-CoV (вируса атипичной пневмонии). Мутация, которая поменяла код 27 аминокислоты на знак «стоп» делает его последовательность в четыре раза меньше (26 аминокислот вместо 121). На что это влияет? Пока не ясно, но мы знаем, что этот белок сбивает с толку нашу иммунную систему, отключая интерферон, и имеет непосредственное отношение к цитокиновому шторму. Возможно, потеря функции этого белка повлияет на течение болезни, но это еще необходимо установить экспериментально. Ну и самая известная мутация N501Y (замена аминокислоты на позиции 501) находится в ключевом контактном участке белка-шипа, состоящем из 6 аминокислот. Предполагается, что это изменение может значительно повлиять на степень связывания с рецептором АСЕ2.

Какая у нас есть информация о распространении этого варианта? Качество данных зависит от страны (ресурсы для секвенирования и организация тестирования). Примером здесь, пожалуй, является Дания, которая секвенирует до 2000 геномов в неделю. 86 случаев VOC 202012/01 уже было зарегистрировано (11% всех новых случаев), и они развиваются в отдельной ветке, что означает, что имело место локальное распространение варианта. Ситуация же в Великобритании очень беспокоит, стране пришлось объявить новые строгие карантинные меры. Но дело здесь, скорее всего, не только в новом варианте вируса, а также в эпидемиологической ситуации по возвращению с каникул. Вообще относительно новых версий коронавируса важно не делать поспешных решений. Панику порождают высказанные вслух предположения. Так, некоторые британские специалисты высказались о том, что новый вариант опаснее для детей, но по факту, скорее всего, это связано с открытием школ.

Предварительно по эпидемиологическим данным из-за очевидного экспоненциального роста мы видим, что этот вариант возможно более заразен. Но так ли он опасен в плане тяжести болезни? На прошлой неделе британская правительственная комиссия опубликовала результаты исследования, которое говорит о том, что вариант VOC 202012/01 не является более опасным по тяжести заболевания. В этом когортном исследовании участвовали 1769 пациентов, зараженных новым вариантом коронавируса, и их данные сравнили с таким же числом пациентов, зараженных старым вариантом.

Поэтому основной вывод: без паники, новый вариант не так опасен, как его представляет Борис Джонсон!

И четвертый вариант вируса, который следует упомянуть — из Южной Африки под кодовым названием 501Y.V2. Он похож на британский, так как содержит ключевую мутацию N501Y, но появился он независимо от него. Этот вариант доминирует в южно-африканском регионе с ноября 2020 года, на сегодня обнаружен в четырех странах. Было показано, что такое изменение вируса повышает вирусную нагрузку, следовательно, возможно, более эффективно заражает клетки. А в остальном нужно больше данных. Кстати, количество данных напрямую зависит от доходов страны, ведь секвенирование в таком количестве, как в Европе, африканским странам не доступно. А нехорошо от этого нам всем, так как в случае с мутациями «Предупрежден — значит вооружен»! Будем надеяться, что пандемия заставит пересмотреть взгляд на технологическое неравенство.

Будут ли работать вакцины?

Пожалуй, самый обсуждаемый и сложный на сегодня вопрос. Мутации коронавируса обнажают недостатки и преимущества разных подходов к разработке вакцин. Традиционные цельновирионные (содержащие живой или убитый вирус) вакцины, возможно, менее подвержены кардинальному изменению эффективности из-за мутаций. Тогда как новые подходы, использующие часть вируса (белок или РНК), рискуют не сработать, так как изменения в вирусе могут быть слишком значимы. Безусловно, настораживает тот факт, что мутации, укрепившиеся в белке-шипе, могут сделать его неузнаваемым для антител, сформировавшихся после вакцинации. Мутации затронули участки, которые входят в состав самых успешных РНК вакцин от Pfizer/Biontech и Moderna. Основатель компании Biontech Угур Шахин успокаивает: «Да, мы знаем, что некоторые участки мутировали. Но там еще много участков, которые остались нетронутыми и пока нет оснований считать, что вакцина не сработает». К слову, компания Biontech уже проверила более 20 установившихся вариантов вируса, и сейчас проверяет «британский» вариант. Также ученый отметил, что в случае необходимости поменять РНК последовательность, они готовы это сделать за две недели, в короткий срок обеспечив миллионы новых доз. В этом главное преимущество РНК вакцин.

У Мухтара Садыкова есть интересные предположения относительно мутаций на белке-шипе:

«На данный момент есть уже с десяток установившихся мутаций на белке-шипе, которые отличаются от первого Уханьского вируса. А также есть множество других мутаций, которые помогают вирусу избежать распознавания иммунной системой. Сейчас, после массовой вакцинации, у вируса может появиться сильное эволюционное давление, особенно на белок-шип. Это может привести еще ко многим мутациям, что в итоге заставит нас пойти по сценарию ежегодной вакцинации, как с вирусом гриппа».

Доктор Болат Султанкулов, работающий над проектом по использованию нанотел для диагностики коронавирусной инфекции, чуть более оптимистичен: «Я предполагаю, что существующие вакцины все-таки будут работать против нового штамма. Дело в том, в ответ на вакцину формируются поликлональные антитела, а это значит, что если нет кардинальных изменений в форме белка-шипа, антитела, вырабатывающиеся на вакцину, должны физически перекрывать доступ к участку, который связывается с АСЕ2. Однако, это лишь мое предположение и нам нужны экспериментальные данные от производителей вакцин. Единственное, чего мы еще не получили, так это данных о том что вирус слабеет, становится менее агрессивным по симптоматике, переходит в разряд «простудных», так как снижение смертности в основном связано с тем, что мир чуть-чуть научился лечить Ковид-19. После массовой вакцинации мы увидим насколько вирус приспосабливается, так как в популяции есть пул генотипа супер-распространителей, они, в свою очередь, и являются генераторами новых мутаций. Дело в том, что иммунная система супер-распространителей работает по-другому, они своего «летучие мыши». Будет очень интересно, как именно они реагируют на вакцинацию, так как предположительно они вырабатывают меньше антител и дают вирусу возможность мутировать, чтобы избежать иммунного ответа.

Вирус, скорее всего никуда не исчезнет, нам остается лишь наблюдать и быть готовыми к быстрому реагированию. А предположение о том, что он никуда не уйдет и после вакцинации связано с его родичами, вызывающими обычную простуду. Остается надеяться на то, чтобы вирус пошел по их пути и просто ослаб».

Есть некоторые опасения по тому, как происходит сейчас вакцинация от Ковид-19. Дело в том, что она происходит двумя инъекциями. Первая — знакомство с антигеном и появление специфического иммунитета, а вторая — закрепление иммунитета в адекватной для защиты дозе. Существуют опасения, что вакцинация в низкой дозе (например, проведение первой инъекции и задержка второй) будет создавать селективное давление на вирус и даст рост еще большим изменениям. А поэтому не совсем уместно изменение графика вакцинации или вакцинация мизерной доли населения. По словам одного из создателей сайта Neхtstrain.org Эммы Ходкрофт, кампании по вакцинации должны быть быстрыми, масштабными и четко организованными. Если добавить к этому сложности с хранением и транспортировкой РНК вакцин, то задача не из легких.

Одно остается неизменным: изучение мутаций вируса помогает понять природу вируса и нашего иммунного ответа, что, в конце концов, позволит нам предположить, когда закончится вся эта история. Так, иногда изучение мутаций помогает понять природу иммунного ответа. Мухтар и его коллеги в своей другой работе заметили, что SARS-CoV-2 постепенно меняет состав азотистых оснований в геноме, что позволяет ему скрыться от антивирусного белка — ZAP. Ученые показали, что данная эволюция вируса спровоцирована двумя человеческими белками - APOBEC и ZAP, а значит, вирус постепенно учится адаптироваться к механизмам иммунной защиты человека. А человеческие белки в свою очередь, могут напрямую «редактировать» генетический состав коронавируса. Возможно, такое редактирование способно вызывать аутоиммунную реакцию, которая наблюдается у некоторых больных. В целом, более глубокие исследования об изменениях коронавируса только начинаются, а благодаря наличию огромного количества открытых данных, доступных в реальном времени, у ученых всего мира есть возможность их анализировать и делать реальные открытия.

Какие мы можем сделать выводы сейчас?

Сами по себе мутации — нормальный и постоянный для вирусов процесс. Большинство главных мутаций коронавируса не делают его опаснее в плане тяжести заболевания, ведь вирусу не нужно, чтобы мы умирали быстрее. Однако, возможно, они делают его заразнее, и для этого уже есть некоторые данные. Мутаций у коронавируса много (в одном только белке-шипе их более 4000), и мы за ними тщательно следим. Влияние этих мутаций на эффективность вакцин пока не было доказано, мы ждем данных от производителей вакцин и независимых лабораторий, которые сейчас проверяют это на новых вариантах.

Что делать нам всем? Дистанцируйтесь и надевайте маски, пока ученые получают больше данных. А мы будем держать вас в курсе новостей.

**Асель Мусабекова ** — биолог и вирусолог, специально для Vласти